PEWARNAAN GRAM

PEWARNAAN GRAM

Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah mikrobiologi

Penulis :

                                                     Ferry Dwi Restu Hendra       

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS SILIWANGI

TASIKMALAYA

2012

PEWARNAAN GRAM

A.    Tujuan

1.      Melihat jenis bakteri gram

2.      Mempelajari pewarnaan gram

B.     Landasan teori

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1.  Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a.       Pewarnaan Asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b.      Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2.  Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

a.  Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b.  Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat	Bakteri garam (+)	Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel	Kandungan lipid rendah (1-4%)	Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin	Lebih sensitif	Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi	Kebanyakan spesies relatif kompleks	Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap perlakuan fisik	Lebih tahan	Kurang tahan

C.      Alat dan Bahan

Alat :

1.      Mikroskop

2.      Lampu spirtus

3.      Kaca objek

4.      Kaca sediaan

5.      Kertas hisap

6.      Jarum inokulasi/ose

Bahan :

1.      Biakan murni dari Streptococus aureus dan E. Coli, atau suspensi dari bekteri tersebut dalam air steril.

2.      Zat warna :

a.       Crystal violet (modifikasi Hucker)

b.      Larutan iodium gram

c.       Safranin

3.      Alkohol 95%

D.    Cara Kerja

1.      Menyiapkan 2 buah kaca objek yang bersih

2.      Membuat film bakteri pada kaca sediaan, dengan garis tengah _ 1cm.

3.      Fiksasi

4.      Memberikan zat warna utama kristal violet selama 2 menit.

5.      Membuang kelebihan zat warna

6.      Membilas dengan air mengalir

7.      Setelah agak kering meneteskan larutan pewarna iodium gram, selama 2 menit.

8.      Membuang kelebihan zat warna

9.      Membilas dengan air mengalir

10.  Meneteskan larutan alkohol 95% sedikit demi sedikit, sehingga larutan yang mengalir dari noda berwarna menjadi tidak berwarna (pemucatan).

11.  Membilas dengan air

12.  Menteskan zat warna penutup, yaitu larutan safranin berwarna merah atau karbon fuchsin selama 2-3 meint

13.  Membuang kelebihan zat warna

14.  Membilas dengan air mengalir

15.  Menyerap sisa air dengan kertas hisap

E.     Hasil Pengamatan

1.      Hasil pengamatan bakteri Streptococus aureus

           Berdasarkan gambar berikut dilihat pada perbesaran 10x berwarna merah muda yang berarti bakteri tersebut termasuk Gram negatif dengan pola penataannya berkoloni, Penataan bakteri jenis streptococcus (lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan membentuk rantai). Dari ciri-ciri tersebut bakteri pada preparat olesan tersebut adalah bakteri streptococcus.

 

  

                      Perbesaran 10x   

         

                               Perbesaran 40x

2.      Hasil pengamatan bakteri Escherichia coli

      Berikut adalah gambar bakteri Escherichia coli yang didapat saat praktikum yaitu menghasilkan warna ungu. Berarti bakteri tersebut mampu mempertahankan warna ungu, oleh karena itu termasuk bakteri gram positif.

                                              Perbesara 10x      

                                                     Perbesaran 40x

F.     Pembahasan

Tabel Hasil Pengamatan,

No	Nama	Pengamatan Warna		Hasil
		Ungu	Merah Muda
1	Bakteri Sampel A	-	ü	Bakteri gram negatif
2	Bakteri sampel B	ü	-	Bakteri gram positif

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:

a.  Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.

b.  Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.

c.  Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.

Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

a.  Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b.  Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c.  Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d.  Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.

Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.

Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 95% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 5 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 95% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 95%

gram + : lipid << + alkohol 95%  pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci)

gram - : lipid >> + alkohol 95%        pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci)

Alkohol 95% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 5 detik kemudia dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di dalam gelas benda.

Setelah pembilasan reagen alkohol 95% pada gelas benda sebelumnya, selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

G.    Kesimpulan

1.      Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni bakteri gram positif dan gram negatif. Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan bakteri antara lain:

a.  Pembuatan olesan bakteri

b.  Fiksasi

c.  Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.

2.  Teknik pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

a.  Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

3. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel A dapat dikelompokkan dalam bakteri gram negatif karena menunjukkan warna merah muda ketika diamati di bawah mikroskop.

4.  Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel B dapat dikelompokkan dalam bakteri gram positif karena menunjukkan warna ungu ketika diamati di bawah mikroskop.

DAFTAR PUSTAKA

Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. [online].tersedia : http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. [19 oktober2012]

Dwijoseputro, d. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Fajriana, Rizki. 2008. Mikrobiologi Umum Pewarnaan Gram. http //pewarnaan bakteri\Mikroum…Pewarnaan Gram « RIZQI FAJRIANA BLOG’S.htm/. 19 oktober 2012.